細胞轉染在科學研究中扮演著十分重要的角色,但也是最容易被忽略的一環(huán)。轉染效率的高低不僅影響實驗結果,甚至可能導致得到的實驗結果是無效的。在多種類型核酸的細胞轉染實驗中,研究者們常需要進一步優(yōu)化轉染條件以達到最優(yōu)的轉染效率,特別是較難轉染的細胞,而針對特定細胞類型選擇對應專業(yè)化的轉染試劑只是邁向轉染實驗成功的第一步。
成立于1995年的Mirus Bio,專注及深耕核酸遞轉領域多年,從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別、可用于AAV和LV生產的TransIT-VirusGEN® (產品年鑒請見圖1)。直至文稿發(fā)布時,使用Mirus產品發(fā)表文章已超過1萬篇,并且發(fā)表文章及Mirus數據庫涵蓋了超過1200種細胞類型。
圖1 Mirus產品年鑒
在細胞轉染實驗中,研究者們常常會忽略轉染效率/成功率的評估,那么是否有對應技術或者方法允許實時監(jiān)測DNA/RNA的成功遞送以及細胞內的分布狀態(tài)呢?Mirus Bio Label IT® 核酸標記試劑盒為廣大的科研工作者提供了一個方向。Label IT® 核酸標記試劑盒可對任何類型核酸,進行高效、直接的標記,并且為on-step的實驗操作。基于非酶反應的標記方法,在不損傷核酸完整性、不影響基因表達的前提下,將選擇的標記 (熒光、生物素、地高辛等)以共價的方式連接到核酸上。
Label IT® 試劑盒有多種標簽可供選擇,包括 Cy®3、Cy®5、CX-羅丹明、TM-羅丹明、熒光素、MFP488、地高辛、生物素和二硝基苯基(DNP)。Label IT® 核酸修飾試劑盒(胺)也可用于基于胺的功能基團進行DNA或RNA修飾。產品特點如下:
- 可用于標記任何DNA或RNA模板——適用于多種應用 (In vitro & in vivo),如Crispr基因編輯、核酸遞轉、RNA干擾/表達實驗、FISH、Microarray等;
- 一步法標記——簡單、輕松即可完成穩(wěn)定的模版標記反應;
- 可根據實驗需求或應用,調節(jié)標記的密度——以獲得最佳檢測標記 DNA 或RNA 的靈敏度;
- 基于共價化學反應——對核酸殘基的修飾為永久性、無損傷的,是多種科研應用的理想選擇。
- 什么是核酸標記?如何標記核酸?如何檢測?
絕大多數基于分子和生物學的In vitro 及 in vivo研究都依賴于核酸的標記或標簽,理想情況下,此類標記或標簽不會影響核酸功能以及研究結果。因此,也發(fā)展出來多種核酸標記方式,大致可以歸為以下兩類:
- 化學標記法:基于結合核酸的反應基團,比如Mirus Label IT® 核酸標記試劑盒屬于此類,并且整個反應過程并不需要酶的參與。
(1) 標簽/標記 (綠色區(qū)域);
(2) Linker,與核酸進行靜電相互作用 (黃色區(qū)域);
(3) Label IT® 試劑以共價形式連接到核酸中活性雜原子的烷基化基團(藍色區(qū)域)。
圖2. Label IT®標記分子示意圖
- 基于酶反應標記法:通過酶促反應,在該反應過程中加入標記修飾的核酸。
當待研究的核酸加入標記后,可通過以下兩種方式進行檢測:
- 直接檢測:這時,標記的核酸中包含了可用于光學、發(fā)光或產生熒光信號的報告分子。
- 間接檢測:標記的核酸帶有標簽或標記,該標記需要特異性的結合報告偶聯分子,如生物素結合帶有熒光標記的鏈霉親和素,地高辛結合帶有熒光標記的特異性抗體等。
- Label IT® 核酸標記試劑盒——不改變核酸結構功能
基因沉默相關功能研究在分子和細胞生物學中發(fā)揮著重要作用,化學轉染也在該研究領域扮演者重要角色。小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA),常作為研究各種類型細胞中蛋白功能核酸類型,通過有效的knockdown從而影響基因表達。那么,加入Label IT®標記的核酸,是否會改變核酸結構,從而影響到后續(xù)實驗結果呢?
評估測試使用Label IT® siRNA Tracker? 試劑盒,將相同siRNA加入不同標記 (CyTM3, CyTM5, 熒光素, CX-羅丹明 )以及沒有標記siRNA,轉染后,可通過熒光顯微鏡觀察到帶有標記的siRNA?;虮磉_結果顯示,帶有不同標記的siRNA,其目的基因表達水平近似,意味著加入Label IT®標記的核酸,并不影響目的基因表達及功能 (圖3)。
圖3 Label IT® siRNA Tracker? 試劑盒評估測試
- Label IT® 核酸標記試劑盒——前沿應用舉例
應用一:使用Label IT®技術,富集CRISPR'd細胞
Nasri 和 Mir 等人在文章中闡述了如何通過 Label IT® 技術,富集 CRISPR/Cas編輯成功的細胞?;蚪M編輯實驗面臨最大的挑戰(zhàn)之一是如何從未編輯的細胞中成功的篩選/富集出成功編輯的細胞,特別當未被編輯的細胞相對于成功編輯的細胞,具有生長/增殖優(yōu)勢,使得細胞篩選變得更加困難。
為了高效的區(qū)分經過基因編輯及未編輯的細胞,作者在CRISPR引導RNA ( gRNA) 與 Cas9 形成復合物及轉染細胞前,使用Label IT®對gRNA進行了熒光標記,實驗流程示意圖如下:
研究結果表明,使用Label IT®標記的gRNA 不會影響基因編輯效率,并且可通過熒光分選/富集成功編輯的細胞群。進一步地,研究者們將該 CRISPR 實驗流程應用于針對多種細胞類型的GADD45B基因編輯實驗。根據細胞類型的不同,經過Label IT®標記的細胞亞群中,其成功編輯細胞占比相對于總細胞群體提了15-40%。
發(fā)表文章信息:
標題: Fluorescent labeling of CRISPR/Cas9 RNP for gene knockout in HSPCs and iPSCs reveals an essential role for GADD45b in stress response
作者: Masoud Nasri, Perihan Mir et al.
雜志: Blood Adv, Volume 3(1), Jan 2019.
DOI: 10.1182/bloodadvances.2017015511
應用二:使用Label IT®技術,聚焦于免疫系統研究
Label IT® 核酸標記技術可用于一種新型疫苗注射方法-微針陣列(microneedle array, MNA)的表征研究。傳統的疫苗注射方法是通過 3 厘米以上長度的針頭進行皮下注射,而微針陣列則是由微米級針頭所組成(示意圖如下),以無痛的方式細微的的穿透皮膚,進入到富含免疫細胞群,可減少患者的不適感。
為了提高疫苗的效力(efficacy),通常會將免疫刺激分子或 "激動劑(agonists) "與疫苗的靶標或抗原一同加入疫苗制劑中。Edwards 等人的研究表明,雙鏈 polyIC RNA 和單鏈 CpG DNA 寡核苷酸可作為微陣列中的激動劑(agonists)。并且,研究者們認為帶負電荷的核酸激動劑(agonists)和帶正電荷的抗原之間的靜電相互作用,幫助了微陣列的組裝。通過使用 Label IT® Cy®3 和 Cy®5 ,分別針對以上兩種核酸類型進行熒光標記,方便用于查看標記核酸在微針上的分布,這樣就允許了研究者們按照所需要的特定比例,將兩種激動劑均一的加入到微陣中,從而使得精確的調整微針陣列 MNA 疫苗的免疫反應成為可能。
發(fā)表文章信息:
標題: Tuning innate immune function using microneedles containing multiple classes of toll-like receptor agonists
作者: Camilla Edwards, Robert Oakes et al.
雜志: Nanoscale, Volume 15, Apr 2023.
DOI: 10.1039/D3NR00333G
- Label IT® 核酸標記試劑盒-產品選擇
Label IT®試劑盒共有以下四種形式可供選擇,以應對研究人員核酸標記實驗的不同應用場景需求:
- Label IT® Nucleic Acid Labeling Kits
- Label IT®Tracker? Intracellular Nucleic Acid Localization Kits
- Label IT® siRNA Tracker? Intracellular Localization Kits
- Label IT® Nucleic Acid Modifying Kits
下表總結了不同種類Label IT®試劑盒區(qū)別:
|
Label IT® Nucleic Acid Labeling |
Label IT® Tracker? |
Label IT® siRNA Tracker? |
Label IT® Nucleic Acid Labeling Modifying |
應用 |
in vitro & in vivo應用的多種類型核酸標記 |
in vitro & in vivo質粒追蹤實驗 |
in vitro & in vivo siRNA追蹤實驗 |
DNA氨基修飾 |
試劑盒組分 |
Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer Reagent D1& Buffer N1 G50 Microspin Columns |
Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer |
Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer siRNA Dilution Buffer |
Label IT® Reagent Reconstitution Solution 10X Labeling Buffer Reagent D1& Buffer N1 G50 Microspin Columns |
Label IT® : 核酸比例 |
1 μl : 1 μg |
0.5 μl : 1 μg |
1 μl : 1 μg |
0.5 μl : 1 μg |
標記密度 |
每20-60 bp 1個標記 |
每60-140 bp 1個標記 |
每15-40 bp 1個標記 |
每20-60 bp 1個標記 |
標記物類型 |
Cy®3 Cy®5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 MFP488 地高辛 DNP |
Cy®3 Cy®5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 |
Cy®3 Cy®5 熒光素 CX-羅丹明 TM-羅丹明 生物素 |
氨基 |
試劑盒規(guī)格 |
25 μl 100 μl |
50 μl |
50 μl |
25 μl 100 μl |
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- Label IT® 核酸標記試劑盒-實驗優(yōu)化之核酸標記密度
理想的密度取決于被標記的核酸類型及下游應用。在需要直接追蹤核酸的實驗中,更適合較高的核酸標記密度;而在想要維持/完整的還原標記核酸的生物學功能的實驗中,則更加適合較低的標記密度。使用 Label IT® 核酸標記技術,可以輕松調整到理想的標記密度。
Label IT® 試劑與核酸的比例(v:w)的改變與標記密度呈線性相關性(圖 4)。例如,按照說明的初次實驗建議,需加入 5 μl Label IT® 試劑標記 5 μg DNA,此時v:w比例為1:1。在保證孵育時間和 DNA 量不變的條件下,如將 Label IT® 試劑的量降低為 2.5 μl 或 增加到10 μl,標記密度將分別降低一半或增加一倍。
實驗Tips:使用過高的 Label IT® 試劑量(超過建議量的 4 倍),可能會導致核酸裂解或引起 Label IT® 熒光基團淬滅。
核酸標記密度與所使用的 Label IT® 試劑量及反應的孵育時間呈正線性相關。可通過調整反應中 Label IT® 試劑的用量或反應的孵育時間 (孵育溫度仍為37℃),可輕松靈活的調整到所需要的理想標記密度。
圖4. 核酸標記密度與Label IT®試劑用量和反應孵育時間成正比
實驗Tips:如何計算核酸標記密度,詳細實驗步驟及方法請見“Calculate Nucleic Acid Labeling Density”。
Mirus Bio公司介紹
Mirus成立于1995年,始終秉承著為基因遞轉提供優(yōu)化方法及高效的工具。憑借超過 25 年轉染領域的深根細作,獲得了多項技術突破,已成為核酸遞送領域的全球領導者和值得信賴的品牌。Mirus科學家團隊不斷突破轉染技術的極限,推出了VirusGEN®轉染試劑與RevIT?增強劑,進一步提升AAV/Lv產量,助力推動生物治療藥物的降本增效,為CGT領域客戶賦能。
北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)總代理,始終秉承著專業(yè)、嚴謹的態(tài)度為客戶提供優(yōu)質的產品與服務,Mirus熱銷轉染產品常備現貨。如果您對上述產品感興趣,歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網站www.daihuang.net.cn了解更多產品信息。